Wehrmedizinische Monatsschrift

Simultane Quantifizierung der
Oximtherapeutika Obidoxim, ­Pralidoxim und HI-6 (Poster-Abstract)

Analyse von Plasmaproben eines pestizidvergifteten Mannes unter Oximtherapie

Tamara Kranawetvogl a, b, Dirk Steinritz a, b,Horst Thiermanna, Harald John a

a Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr, München, Deutschland

b Walther-Straub-Institut, Ludwig-Maximilians-Universität, München, Deutschland

 

Hintergrund

Organophosphate können hochtoxische Verbindungen sein, die durch ihren Einsatz als Pestizide und chemische Kampfstoffe eine Gefahr sowohl für die zivile Bevölkerung wie auch für Soldatinnen und Soldaten darstellen. Eine Intoxikation führt zu einer Inhibition des Enzyms Acetylcholinesterase (AChE). Dies hat die Akkumulation des Neurotransmitters Acetylcholin im synaptischen Spalt mit darauffolgender Überstimulation cholinerger Rezeptoren zur Folge. Im weiteren Verlauf kann dies zu einer cholinergen Krise mit oft tödlichem Ausgang durch zentrale Atemlähmung führen.

Die derzeit verfügbaren Therapieoptionen können nicht bei allen phosphororganischen Verbindungen erfolgreich eingesetzt werden und sind bei Hochdosisintoxikationen nur eingeschränkt wirksam. Ein universell einsetzbares Antidot ist derzeit noch nicht verfügbar, weshalb die bereits bestehende Therapie weiter optimiert werden soll. Im Fokus stehen hierbei die kausal wirkenden Oximtherapeutika Pralidoxim (2-PAM), Obidoxim (Obi) und HI-6 (Abbildung 1), welche als Reaktivatoren der AChE agieren. Aufgrund individueller Wirkspektren der Oxime könnte eine kombinierte Gabe therapeutische Lücken schließen.

Methode

Für die Durchführung und Bewertung von pharmakokinetischen Studien wurde eine neue Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Methode mit Diodenarray-­Detektion (HPLC-DAD) entwickelt und validiert. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung sowohl eines einzelnen Oxims wie auch die simultane Bestimmung von Obi, 2-PAM und HI-6 aus Plasma (Abbildung 2).

Die chromatographische Trennung erfolgt innerhalb von 15 min auf einer Waters Atlantis T3 Säule (150 x 2,1 mm I.D., 3 µm, 100 Å) mit einem Fluss von 0,4 mL/min bei 35 °C und einem Injektionsvolumen von 10 µL. Als ­Eluenten werden 0,1 % v/v Trifluoressigsäure (TFA, ­Eluent A) und Acetonitril/Wasser 80 : 20 v/v, 0,1 % v/v TFA (Eluent B) mit folgendem Elutionsprofil eingesetzt:

Zeit [min]/B [%]: 0/0; 7/0; 8/80; 10,5/80; 11/0; 15/0.

Die Analyten und der interne Standard 4-Pyridinaldoxim (4-PAO) werden jeweils bei ihrem individuellen λmax-Wert detektiert):

• λmax (Obi) = 285 nm,
• λmax (2-PAM) = 293 nm,
• λmax (HI-6) = 300 nm und
• λmax (4-PAO) = 273 nm.
  

  Abb. 2: Simultane HPLC-DAD Analyse einer mit allen Oximen gespikten Plasmaprobe: Das Chromatogramm wurde durch Analyse einer mit drei Oximen gespikten Probe (jeweils 3,8 µg/mL Obi, 2-PAM und HI-6; 16,8 µg/mL 4-PAO) erhalten.

  Durch Ausfällung von Proteinen mit 5 % w/v wässriger Zinksulfatlösung und Acetonitril in zwei aufeinanderfolgenden Schritten können störende Matrixbestandteile aus Plasma auf ein Minimum reduziert werden.

  Ergebnisse

  Die Wiederfindung für alle Analyten lag zwischen 94,2 und 101,1 %. Selektivitätsprüfungen mit Plasma von 8 verschiedenen Individuen zeigten keine Interferenzen, so dass eine Quantifizierung im Bereich von 0,12 bis 120 µg/mL möglich ist. Der therapeutisch relevante Konzentrationsbereich in Plasma wird damit für alle drei Oxime abgedeckt.

  Untersuchungen zu Intra- (Genauigkeit 91,7 - 98,6 %, Präzision ≤ 4,4 %) und Interdayvariationen (Genauigkeit 89,4 - 97,4 %, Präzision ≤ 2,2 %) dokumentierten exzellente Eigenschaften für eine quantitative Methode. Aufgearbeitete Proben sind für mindestens 12 h bei 15 °C im Autosampler stabil. Eine leichte Veränderung der Detektionswellenlänge, der Temperatur oder des Flusses hatte keinen verschlechternden Einfluss auf die Quantifizierbarkeit der Analyten. Oximhaltige Plasmaproben waren für mindestens vier Einfrier-Auftau-Zyklen stabil.

  Ausblick und erste klinische Anwendung

  Nach der Validierung wurde diese Methode erfolgreich zur Quantifizierung der Oximkonzentration in realen Proben eines mit Parathion vergifteten Mannes unter Obidoximtherapie angewendet. Insgesamt wurden 14 Proben analysiert. In 9 Proben konnte eine therapeutisch wirksame Plasmakonzentration (2,8 - 5,8 µg/mL) zwischen 2,6 und 4,5 µg/mL nachgewiesen werden. Die Anwendung der Methode im Rahmen einer pharmakokinetischen Studie mit kombinierter Oximgabe wird in naher Zukunft erfolgen.

  Literatur

1. Eyer P: The role of oximes in the management of organophosphorus pesticide poisoning. Toxicol Rev 2003; 22: 165–190. mehr lesen
2. Marrs TC, Maynard RL, Sidell F (Eds.): Chemical Warfare Agents – Toxicology and Treatment. West Sussex (England) 2007: John Wiley and Sons Inc.
3. Marrs TC, Vale AJ: Management of Organophosphorus Pesticide Poisoning. In: Gupta RC (Ed.): Toxicology of Organophosphate and Carbamate Compounds. Bosto-San Diego- New York 2006: Elevier Academic Press. mehr lesen
4. Peters FT, Hartung M, Herbold M et al.: Richtlinie der GTFCH zur Qualitätssicherung bei forensisch-toxikologischen Untersuchungen, Anhang B: Anforderungen an die Validierung von Analysemethoden, Version 01. GTCH 2009. , aufgerufen am 21. Dezember 2019. mehr lesen
5. US Department of Health and Huamn Services: Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. FDA 2018; , aufgerufen am 20. Dezember 2019. mehr lesen