Wehrmedizinische Monatsschrift

Biologische Evaluation antiviraler Wirkstoffe gegen Enzephalitisviren mittels Lebendzellmikroskopie (Poster-Abstract)

Alessandro Cocca a, Lisa Hurler b, Paola Zanetta c, Rohan Nayaran d, Daniela Friese a, Joachim J. Bugert a

a Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München

b Technische Universität München

c Università degli Studi Milano Bicocca, ERASMUS Program, Milan, Italy

d Cardiff School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Cardiff, UK

 

Einleitung

Die Technologie zur Lebendzellmikroskopie virusinfizierter Zellkulturen und zur Beobachtung von fluoreszierenden Reporterviren in ‚real time‘ wurde in der Arbeitsgruppe Experimentelle Virologie am Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (InstMikroBioBw) etabliert. Die Arbeitsgruppe kollaboriert mit Medizinalchemikern der Universität Cardiff im Rahmen einer Plattform zur Identifizierung antiviraler Wirkstoffe mit Aktivität gegen B-Schutz relevante virale Enzephalitiserreger. Leitverbindungen mit hohem selektivem Index wurden in Einzelzell-Infektionsmodellen charakterisiert. Weitere Aussagen hinsichtlich einer möglichen therapeutischen Wirkung erfordern komplexere Infektionsmodelle. Die Etablierung eines mikroskopischen Modells der Blut-Hirnschranke (BHS) erfordert die Fähigkeit zur Lebendzellmikroskopie.

Methoden und Ergebnisse

Der im Rahmen der Zusammenarbeit mit der Medizinalchemie der Universität Cardiff etablierte Untersuchungsweg für antivirale Verbindungen (Abbildung 1) umfasst die Reduktion von Kandidatenverbindungen durch Vorselektion in (1.) In silico Modellen in Cardiff (4 Größenordnungen), (2.) biologische Vortestung durch „Screening“ von Kandidatenverbindungen am InstMikroBioBw (eine Größenordnung) und (3.) chemische Strukturoptimierung (Universität Cardiff) anhand der festgestellten Effektivität und Toxizität zur Identifizierung von Leitverbindungen mit verbessertem selektivem Index (therapeutisches Fenster). Hierbei wird die Kandidatenzahl noch einmal um eine Größenordnung reduziert.

Abb. 1: Untersuchungsweg zur Identifizierung antiviraler Verbindungen mit hohem selektivem Index und Aktivität in funktionellen Modellen

Bei der Untersuchung von 140 Kandidatenverbindungen am InstMikroBioBw wurden bisher vier Leitverbindungen (D12/MB124; MB070; BB4D9) aus der Klasse der viralen Polymeraseinhibitoren sowie einem Naturstoffextrakt mit Wirksamkeit gegen B-Schutz-relevante virale Enzephalitiserreger (Zika- und FSME-Virus; Chikungunyavirus, Pockenviren) identifiziert [1][2][6]. Synergie mit cf2642 [5], einem Makropinozytose/ Autophagieinhibitor, wurde festgestellt.

Im vierten Schritt des Untersuchungsweges (Abbildung 1) sollen Wirkstoffe in komplexen Infektionsmodellen für virale Enzephalitiserreger weiter untersucht werden. Solche Modelle erlauben die Bestimmung der ZNS-Gängigkeit und -Aktivität antiviraler Verbindungen, reduzieren dadurch die Zahl der Kandidatenverbindungen weiter (Faktor 5) und sollen auf ihren Vorhersagewert für zukünftige in vivo Untersuchungen (z. B. Tierversuch; klinische Studien) geprüft werden. Falls ausreichend prädiktiv, würden solche Modelle zu Reduzierung/Ersatz der antiviralen Wirktofftestung im Tierversuch vor klinischen Studien (Schritt 5) führen.

Eine für virale Enzephalitiserreger wichtige funktionelle Barriere ist die Passage der Blut-Hirnschranke (BHS; Abbildung 2). Ein mikroskopisch beobachtbares Barrieremodell der BHS soll deswegen für die funktionelle Untersuchung der Wirksamkeit antiviraler Kandidatenverbindungen am InstMikroBioBw etabliert werden.

Abb. 2: Komponenten für ein funktionelles Modell der Blut Hirnschranke (BHS): (1.) Humane Glia-, und Endothelzellen (z. B. Human Umbilical Vein Endothelial cells – HUVEC) in einem Lebendzellmikroskopiersystem (z. B. ibidiBOX), (2.) grün fluoreszierende Reporterviren, die durch Expression von EGFP die Beobachtung der a. direkten oder b. indirekten Viruspassage durch die BHS erlauben, (3.) antivirale Wirkstoffe, die aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften die BHS direkt passieren, und (4.) ein mikroskopisch beobachtbares Barrieresystem als funktionelles Modell der BHS: ibidi m Flow Slide (Fa. Ibidi) und z- Stack.

Neben den Barrierezellkulturen sind für ein mikroskopisch beobachtbares Barrieresystem fluoreszierende Reporterviren (z. B. Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)) sowie die Fähigkeit zur Lebendzellmikroskopie erforderlich.

Reporterviren

Wegen ihres breiten Wirtszellbereichs, ihrer schnellen Infektionskinetiken und Handhabbarkeit unter S2-Bedingungen wurden initial rekombinante Pockenviren (Vacciniavirus) als Beobachtungsobjekte für die Lebendzellmikroskopie ausgewählt. Das Vacciniavirus wurde als Impfstoff zur Ausrottung der Pocken eingesetzt und wird als Surrogatmodell für Infektionen mit Orthopockenviren angesehen.

Die Insertion von EGFP in das Genom des replikationsfähigen Vacciniavirus Western Reserve (WR) und dadurch verursachte Expression von grünem fluoreszierendem Protein in infizierten Zellen erlaubt die Beobachtung der Virusinfektion in der Lebendzellmikroskopie (Vaccinia Reportervirus, Abbildung 3). Weitere Reporterviren liegen vor (Masernvirus-EGFP, Zikavirus-EGFP) oder werden am Institut konstruiert (FSME Virus-EGFP, Chikungunya Virus EGFP).

Abb. 3: Vaccinia Reporterviren: (A) Titration von Vacciniavirus v300 EGFP in MA104 Zellen, (B) v300 EGFP Reportervirus Konstruktionsdetails (bei v3 LUC wurde Luziferase (LUC) analog anstelle von EGFP in das Pockenvirusgenom integriert), (C) EGFP Expression (grün) in EGFP Reportervirus (v300 EGFP) infizierten HUVEC Zellen und (D) Luziferase Expression (Verdünnungsreihe; relative Lichteinheiten (RLU) in mit v3 LUC Reportervirus infizierten HUVEC Zellen.

Lebendzellmikroskopie

Das fluoreszierende Vaccinia Reportervirus v300 EGFP wurde bei der Lebendzellmikroskopie eingesetzt. Die Beobachtung der Fluoreszenz erfordert den Betrieb einer Inkubatorbox mit CO2-Begasung, Luftbefeuchtung und Temperaturkontrolle an einem Fluoreszenzmikroskop. Eingesetzt wurde der ibidiBOX Inkubator an einem Zeiss Axio Observer Z1 Laserscanningmikroskop (Abbildung 4A). Die Aufnahme von Bilderserien in Phasenkontrast und Fluoreszenzmodus zu vorprogrammierten Zeitpunkten erlaubt die direkte Beobachtung der v300 Virusinfektionskinetik in Echtzeit (Abbildung 4B; Zeitmarker 16 Stunden (h) 30 Minuten post infectionem (pi)).

Bilderserien wurden in An- und Abwesenheit von antiviralen Wirkstoffen (Cidofovir™; cf2642) in ibidi µ-Slides (8 well Format) durchgeführt [3]. Das verwendete Mikroskop verfügt über einen motorisierten Tisch. Die horizontale Beobachtung verschiedener Objekt-Wells sowie die Zeitpunkte der Bilderfassung wurden mithilfe der Zeiss Steuersoftware programmiert. Im nächsten Schritt sollen analog ibidi µ-Membrane-ibiPore-Flow-Slides [4] vertikal/horizontal mikroskopiert werden. Der Durchblick durch die BHS-Barriere erfolgt dabei von unten nach oben (vertikal), an verschiedenen Orten (horizontal) und – wie bereits etabliert – zu bestimmten Zeitpunkten in einer Infektionskinetik.

Die Lebendzellmikroskopie wird im Rahmen des vitro Modells der BHS im Mikroformat am InstMikroBioBw im Rahmen einer Dissertationsarbeit weiterentwickelt.

Abb. 4: (A) Fluoreszenz-Lebendzellmikroskopie im ibidiBOX Inkubator am Z1 konfokalen Laserscanning Mikroskop, (B) Auswertung und Dokumentation der Bilderserie mit imageJ Software; (C) animierte Darstellung ├╝ber 16,5h (4 Bilder/h)

Zusammenfassung

Während moderne Nachweisverfahren innerhalb kürzester Zeit die Identifikation und Verifikation B-Schutz relevanter viraler Agentien erlauben, steht nach festgestellter Exposition Ungeimpfter jedoch in den meisten Fällen keine spezifische antivirale Therapie zur Verfügung. Etwa die Hälfte der relevanten viralen Erreger verursacht im Rahmen schwerer Systemerkrankungen auch eine Enzephalitis, deren erfolgreiche Behandlung eine Passage intravenös verabreichter antiviraler Wirkstoffe über die BHS ins ZNS erfordert. In vitro-Infektionsmodelle erlauben eine Einschätzung der ZNS-Gängigkeit antiviraler Kandidatenverbindungen und damit auch der Erfolgsaussichten im Tierversuch. Geeignete in vitro-Modelle könnten in der Zukunft Tierversuche ersetzen oder zumindest ihre Anzahl reduzieren.

Die erfolgreiche Etablierung der Lebendzellmikroskopie am InstMikroBioBw ist ein wichtiger Schritt und eine Grundvoraussetzung zur weiteren Entwicklung unseres Blut-Hirnschrankenmodells und Prüfung der ZNS-Gängigkeit und -Aktivität antiviraler Verbindungen.

Literatur

  1. Coluccia A, Mastrangelo E, La Regina G, Bugert JJ, Lee J, Silvestri R: New agents targeting ZIKV protease or methyl-transferases. Medical Biodefense Conference Oct 28-31, 2018, Munich. Abstract - GO 04. mehr lesen
  2. Hucke F: Biologische Evaluation Antiviraler Wirkstoffe versus Chikungunyavirus (CHIKV). Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med. vet. der Ludwig-Maximilians-Universität München; vorgelegt im Juni 2019.
  3. Hurler L: Biological Evaluation of Antiviral Agents Against Encephalitis Viruses in Live Cell Microscopy. Arbeit zur Erlangung des Masters of Science der biologischen Fakultät der Technischen Universität München, vorgelegt im März 2019.
  4. Ibidi GmbH, Martinsried: µ–Slide Membrane ibiPore Flow System. , letzter Aufruf 19. Januar.2020. mehr lesen
  5. McGuigan C, Hinsinger K, Farleigh L, Pathirana RN, Bugert JJ: Novel antiviral activity of l-dideoxy bicyclic nucleoside analogues versus vaccinia and measles viruses in vitro. Journal of Medicinal Chemistry 2013; 56: 1311-1322. mehr lesen
  6. Zanetta P: Efficacy evaluation of natural extracts against Poxviruses using a Western Reserve modified Vaccinia Virus infection model in cell culture. Arbeit zur Erlangung des Masters in Medical Biotechnology der UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO BICOCCA, School of Medicine and Surgery, in Mailand, vorgelegt im März 2019 im Rahmen eines ERASMUS Aufenthalts am InstMikroBioBw, München.

 

Manuskriptdaten

Zitierweise

Cocca A, Hurler L, Zanetta P, Nayaran R, Friese D, Bugert JJ: Biologische Evaluation antiviraler Wirkstoffe gegen Enzephalitisviren mittels Lebendzellmikroskopie (Poster-Abstract). WMM 2020; 64(3-4); 130-133.

Für die Verfasser

Flottillenarzt Priv.-Doz. Dr. Joachim J. Bugert

Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr

Neuherbergstr. 11, 80937 München

E-Mail: joachim1bugert@bundeswehr.org

Posterpräsentation beim 50. Jahreskongresse der Deutschen Gesellschaft für Wehrmedizin und Wehrpharmazie e. V. in Leipzig, 10.-12. Oktober 2019