COVID-19-DIAGNOSTIK

SARS-CoV-2- Diagnostik in der Abteilung XXI
des BundeswehrZentralkrankenhauses Koblenz

Carsten Balczun a, Heike Granzera, Ingo Fengler a, Sandra Rojak a, Niklas Klein a,
Patrick Scheid a, Ralf Matthias Hagen a

a BundeswehrZentralkrankenhaus Koblenz, Abteilung XXI – Mikrobiologie und Krankenhaushygiene

 

Einleitung

Die Abteilung XXI – Mikrobiologie und Krankenhaus­hygiene – des BundeswehrZentralkrankenhauses (BwZKrhs) Koblenz weist eine Besonderheit auf: Neben der Sektion A, deren Kernaufgabe, wie in den anderen Bundeswehrkrankenhäusern, die Routinediagnostik für die Patientenversorgung des jeweiligen Hauses ist, gibt es nur in Koblenz eine Sektion B. Hier werden neben speziellen diagnostischen Untersuchungsleistungen Fragestellungen der populationsbezogenen Infektiologie im Sinne eines „Public Health Labors“ bearbeitet. Stationäre Kernelemente dieser Sektion B sind Medizinische Parasitologie, Infektionsepidemiologie, spezielle Molekularbiologie (inkl. Infektkettenaufklärung und –diagnostik), Medizinische Zoologie und die Einsatzunterstützung nebst Telemedizin bzw. Telemikrobiologie. Als Leitlabor für Mikrobiologie betreut die Abteilung die mikrobiolo­gischen Einsatzlabore und ergänzt bei Bedarf deren ­infektionsdiagnostischen Untersuchungsleistungen mit dem „Rapidly Deployable Outbreak Investigation Team ­(RDOIT-Public Health)“ für die infektiologische und epidemiologische Untersuchung eines Ausbruchsgeschehens.

Der Teileinheit für die Spezielle Molekularbiologie, Infektkettenaufklärung und –diagnostik kommt bei der gegenwärtigen Pandemie eine besondere Aufgabe zu: In diesem Laborbereich ist die „spezielle molekularbiologische Diagnostik“ des Sanitätsdienstes der Bundeswehr zentralisiert. Hier wird auf solche Ausbruchsgeschehen reagiert, bei denen die Erreger (noch) nicht durch in der Routinediagnostik etablierte Methoden nachgewiesen werden können. Durch eine rasche Marktsichtung werden geeignete molekularbiologische Teste identifiziert, im Labor validiert und anschließend in die Routineanwendung gebracht. Bei Bedarf, d. h. wenn der Markt keine adäquaten Testsysteme zur Verfügung stellt, werden solche molekularbiologischen Nachweisverfahren auch als „in-house“-Teste entwickelt. Im Folgenden sollen die Abläufe für die rasche Etablierung der SARS-CoV-2–Labordiagnostik innerhalb der Sektionen der Abteilung XXI am BwZKrhs Koblenz dargestellt werden.

Grundsätzliches zur Diagnostik und Präanalytik

Die Inkubationszeit von COVID-19 beträgt nach derzeitiger Einschätzung 1-14 Tage, im Median 5-6 Tage. Tatsächlich kann das Virus bereits 1-2 Tage vor Symptombeginn – also auch von asymptomatischen Trägern – ausgeschieden werden. Für den direkten Nachweis von SARS-CoV-2 aus Patientenmaterial eignet sich die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR), die für das RNA-Virus SARS-CoV-2 als Real-Time reverse Transkription-PCR (RT-qPCR) durchgeführt wird. Als Probenmaterial eignen sich in einem frühen Stadium der Infektion Abstriche der oberen Atemwege (z. B. Nasopharyngealabstriche). Zu einem späteren Stadium ist die Untersuchung von Probenmaterial aus den tieferen Atemwegen (Sputum, Trachealsekret, Bronchial­lavage) erfolgversprechender. Bei Verwendung der Abstrich- und Transportsysteme ist darauf zu achten, dass sie den Nachweis durch molekularbiologische Techniken erlauben. Transportmedien für Viren sind gut geeignet und ermöglichen zudem die kurzfristige Lagerung bei 2-8 °C. Entsprechende Transportsysteme (Tupfer und Transportmedium) können im Labor für Medizinische Parasitologie und Zellkultur der Sektion XXIB angefordert werden. Nicht gezielte Tätigkeiten im Rahmen der Labordiagnostik (also PCR) sind unter Beachtung der Vorgaben des Ausschusses für biologische Arbeitsstoffe (ABAS) unter der Schutzstufe 2 durchzuführen, gezielte Tätigkeiten, bei der es zur Vermehrung replikationsfähiger Viren kommt (also Zellkulturverfahren), sind Laboren der Schutzstufe 3 vorbehalten.

Entwicklung der SARS-CoV-2-Pandemie
und erste diagnostische Verfahren

Ende Dezember 2019 wurden Informationen über einen Ausbruch von respiratorischen Erkrankungen mit unbekannter Ätiologie in der chinesischen Stadt Wuhan, Provinz Hubei, bekannt, deren Erreger Anfang Januar durch chinesische Regierungsbehörden als ein neuartiges Coronavirus (CoV) mit der Bezeichnung 2019-nCoV identifiziert wurde (Abbildung 1). Chinesische Arbeitsgruppen veröffentlichten zwischen dem 10. und 12. Januar 2020 insgesamt fünf Vollgenomsequenzen des neuen Coronavirus [7], wodurch die enge Verwandtschaft zum severe acute respiratory syndrom (SARS) CoV, welches für die SARS-Pandemie 2002/03 verantwortlich war, belegt werden konnte.

Basierend auf in silico-Analysen schon bekannter Beta-Coronaviren und daran anschließend gestützt durch die Genomdaten von SARS-CoV-2 konnte sehr zeitnah durch CORMAN et al. ein erster molekularbiologischer Nachweis für das neuartige CoV als RT-qPCR etabliert werden [2]. Als ein sensitiver Screening-Nachweis wird zunächst ein Genabschnitt für das Hüllprotein (engl. envelope, E-Gen) amplifiziert, wobei neben SARS-CoV-2 auch SARS-CoV und einige fledertier-assoziierte Coronaviren der Untergattung Sarbecovirus detektiert werden. Als spezifischer Bestätigungs-Assay für SARS-CoV-2 wird dann ein Abschnitt des Gens für die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP-Gen) amplifiziert. Weder der Screening-Assay noch der Bestätigungs-Assay zeigen eine Kreuzreaktion mit den bisher bekannten humanpathogenen respiratorischen Coronaviren NL63, 229E, HKU, OC43 oder MERS. Die World Health Organization (WHO) hat das Testprotokoll als zu diesem Zeitpunkt ersten diagnostischen Leitfaden veröffentlicht [6].

Aufbau der SARS-CoV-2-PCR in der Abteilung XXI

Aufgrund der zunehmenden Präsenz der Epidemie in China in den Nachrichten und einer sich daraus möglicherweise entwickelnden Pandemie wurde in der Sektion XXI B des BwZKrhs Koblenz Ende Januar 2020 die Entscheidung getroffen, die molekularbiologische Diagnostik des zu diesem Zeitpunkt noch als 2019-nCoV bezeichneten Virus in der Abteilung zu etablieren (Abbildung 1). Unterstützung erfolgte hierbei durch das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (InstMikroBioBw) in München, wo die RT-qPCR nach dem Protokoll von CORMAN et al. [2] kurz zuvor innerhalb der Bundeswehr als erstes etabliert wurde.

Die Validierung der Nachweismethode für das inzwischen als SARS-CoV-2 bezeichnete Virus für die manuelle und automatisierte Nukleinsäureaufreinigung erfolgte bis Mitte Februar 2020 in der Sektion XXI B. Die nötige Sensitivitätstestung konnte mit Hilfe von Positivkontrollen aus dem InstMikroBioBw durchgeführt werden. Bei der Spezifitätstestung wurden Nukleinsäuren verschiedener pneumotroper Viren verwendet, die im Labor für Zellkultur der Abteilung XXI (Sektion B) auf suszeptiblen Zelllinien angezüchtet wurden.

Die Diagnostik erfolgt auf zwei Geräteplattformen, die als offene Systeme die automatisierte Aufreinigung von Nukleinsäuren und anschließende Durchführung einer PCR im Hochdurchsatz ermöglichen, um die Diagnostik im Rahmen eines Ausbruchsgeschehens mit einer hohen Probenanzahl sicherzustellen (Abbildung 2).

Durch ständigen Ausbau der Testkapazitäten und des Personalpools – auch durch Unterstützung durch Personal anderer Dienststellen sowie hinzugezogene Reservedienstleistende – konnte die Diagnostik regelhaft mit einer Kapazität von bis zu 200 Proben täglich auch am Wochenende in der Abteilung XXI angeboten werden. Tabelle1 gibt eine Übersicht der bis Anfang Juni 2020 durchgeführten PCR-Teste auf SARS-CoV-2. Die Durchführung der Diagnostik in einer Abteilung der Klinik hat den entscheidenden Vorteil des kurzen Kommunikationswegs, so dass durch zeitnahe Befundmitteilungen Ergebnisse in der Regel innerhalb eines Tages für therapeutische Entscheidungen in der Klinik bereitstehen.

Aufgrund der (initial deutlich gewordenen) schwierigen Versorgungslage, insbesondere mit Verbrauchsmate­rialien und Reagenzien, wurde kontinuierlich eine Marktsichtung mit Bewertung durchgeführt und im Zuge ­dessen neben den etablierten Nukleinsäureaufreinigungsverfahren und RT-qPCR-Teste alternative Testsysteme beschafft und orientierend evaluiert.

Kontinuierliche Evaluation weiterer ­Labordiagnostik in der Abteilung XXI

Innerhalb der relativ kurzen Zeit, in der sich die SARS-CoV-2-Epidemie zur Pandemie ausgeweitet hat, sind von den Herstellern für Diagnostikprodukte zahlreiche Diagnostikverfahren für das neuartige Coronavirus, ob als molekularbiologischer Nachweis oder Antikörpernachweisverfahren, entwickelt worden [3]. Der folgende Abschnitt gibt einen Überblick über die aktuell möglichen und in der Evaluierung befindlichen Testsysteme für die SARS-CoV-2-Diagnostik in der Abteilung XXI.

Kompakte Testsysteme für die ­Nukleinsäureamplifikation

Seit einigen Jahren sind kompakte und vor allem einfach anzuwendende Testsysteme für die Nukleinsäureamplifikation erhältlich, die speziell für die patientennahe Testung („point of care“) entwickelt wurden. Die Durchführung stellt nur geringe Ansprüche an den Ausbildungsstand des Personals und Testergebnisse sind in unter einer Stunde verfügbar.

Die Patientenprobe wird in der Regel direkt in die Testkartusche eingebracht, die alle Reagenzien für Nukleinsäureaufreinigung und anschließenden Nachweis der SARS-CoV-2-RNA durch RT-qPCR als geschlossenes System enthalten. Testsysteme mehrere Hersteller besitzen bereits eine IVD-CE-Zertifizierung oder stehen kurz davor diese zu erhalten. In der Abteilung XXI stehen Plattformen für die Anwendung solcher Testkartuschen zur Verfügung, für die vergleichende Validierung weiterer Systemplattformen sind die Voraussetzungen geschaffen worden. Erste vorläufige Ergebnisse beim Vergleich eines Kartuschensystems mit der in der Abteilung XXI etablierten RT-qPCR nach WHO-Vorgaben zeigen eine geringere Sensitivität der Testkartuschen. Für eine valide abschließende Bewertung des Methodenvergleichs findet weiterhin eine parallele Testung des Kartuschensystems und der RT-qPCR mit Patientenproben statt.

Als weitere Einschränkung des Kartuschensystems ist zu erwähnen, dass lediglich Nasopharyngealabstriche bzw. Waschlösungen als Probenmaterial zugelassen sind.

SARS-CoV-2-Antigennachweise

Im akuten Stadium der Erkrankung bietet ein Antigennachweis eine weitere Möglichkeit, den Erreger direkt aus dem Untersuchungsmaterial der oberen Atemwege nachzuweisen. Es handelt sich hierbei (meist) um in der Anwendung einfache Streifentests nach dem Lateral-Flow-­Prinzip, bei denen monoklonale Antikörper gegen Oberflächenproteine des Viruspartikels wie das Nukleokapsidprotein und/oder die S1-Domäne des Spikeproteins verwendet werden. Ein qualitatives Ergebnis ist nach kurzer Zeit – testabhängig in etwa 15 min – vorhanden.

Allerdings weisen diese Teste eine der PCR gegenüber geringere Sensitivität auf. Dagegen ist der positiv prädiktive Wert mit >95 % häufig sehr hoch. Der negativ prädiktive Wert ist stark von der Konzentration des Virus in der Probe abhängig und liegt oft unter 50 %. Daher eignet sich dieses Testsystem lediglich für eine orientierende Einschätzung und muss durch eine molekularbiologische Untersuchung ergänzt werden. Antigennachweise verschiedener Anbieter mit IVD-CE-Zertifizierung werden momentan in der Sektion XXI B vergleichend getestet. Die bisher erhaltenen Ergebnisse belegen allerdings deutlich die Limitierung dieser Teste, der Vertrieb eines Testsystems ist in der Zwischenzeit vom Anbieter sogar aufgrund der schlechten Leistungsdaten eingestellt worden.

SARS -CoV-2-Antikörpernachweise

Zu einem späteren Zeitpunkt der Erkrankung sind Antikörperbestimmungen sinnvoll, um die Reaktion des Immunsystems auf eine anhaltende oder durchgestandene Infektion mit SARS-CoV-2 zu zeigen. Die Ermittlung der Seroprävalenz ist auch aus epidemiologischer Sicht sinnvoll, um eine Abschätzung der Herdenimmunität durchführen zu können. Antikörper der Klassen IgA und IgM werden bereits früh nach Erregerkontakt gebildet, Antikörper der Klasse IgG werden offenbar innerhalb oder sogar erst am Ende der zweiten Woche nach SARS-CoV-2-Infektion ausgeprägt [4][5][8]. Somit eignet sich keine Form der Antikörpernachweise für die Akutdiagnostik. Für alle Testsysteme gilt zudem eine starke Abhängigkeit von der Spezifität für das jeweilige verwendete Antigen. Das Ausmaß potenzieller Kreuzreaktivitäten gegenüber anderen endemisch zirkulierenden (Beta)Coronaviren bestimmt den Grad möglicher falsch positiver Ergebnisse. Zudem variiert die Sensitivität der Teste, was sicherlich auch vom Zeitpunkt ihres Einsatzes nach Beginn der Symptome abhängt.

Kassettentests

Die einfachste und schnellste Form des Antikörpertests sind sogenannte Kassettentests, die ebenso wie die Antigenschnellteste als „point of care“-Test in direkter Umgebung des Patienten durchgeführt werden können und nur ca. 15 min benötigen. Je nach verwendetem Test werden IgM- und/oder IgG-Antikörper mit Hilfe des Lateral-Flow-Prinzips nachgewiesen. In der Abteilung XXI werden derzeit mehrere dieser inzwischen auch überwiegend IVD-CE zertifizierten Testkassetten verschiedener Anbieter getestet. Obwohl eine abschließende Bewertung noch aussteht, sind auch hier die Sensitivitätswerte eine offensichtliche Schwachstelle dieser Testsysteme.

ELISA-Testsysteme

In der Infektionsserologie der Abteilung XXI wird die apparative Ausstattung für die Evaluation marktverfügbarer enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA)-Testsysteme für den Nachweis von IgA- und IgG-Antikörpern genutzt. Hier finden Mikrotiterplatten Verwendung, die mit (meist rekombinant erzeugtem) SARS-CoV-2-Antigen beschichtet sind. Sind in der Patientenprobe Antikörper vorhanden, binden sie an dieses Antigen und werden in einem weiteren Reaktionsschritt mit Hilfe eines Photometers erfasst. Die Durchführung dieser Teste verlangt eine entsprechende Laborausstattung und stellt höhere Ansprüche an die Erfahrung des Laborpersonals als die bisher vorgestellten Antikörpernachweisverfahren. Ebenso ist der zeitliche Aufwand bedeutend größer, die Methodik ist aber als Hochdurchsatzverfahren (halb)automatisiert anwendbar und erlaubt eine (zumindest) semiquantitative Aussage zur Menge der vorhandenen Antikörper in der Patientenprobe. Nachdem während der laufenden Evaluation seitens des Herstellers die Testsysteme für den IgA- und IgG-Nachweis optimiert wurde, sind die erhaltenen Resultate so robust, dass die Methode für die Routinediagnostik und epidemiologische Fragestellungen angeboten werden kann (Tabelle 1).

CLIA

Für den IgG-Antikörpernachweis durch die chemiluminescent immunoassay Technik (CLIA) steht eine Hochdurchsatzplattform zur Verfügung, die eine vollautomatische Probenabarbeitung ermöglicht. Seit kurzem verfügbare Teste wurden in der Abteilung XXI positiv validiert und werden nun ebenfalls in der Routinediagnostik angewendet.

Neutralisationstests

Die bisher genannten Methoden für den Antikörpernachweis erfassen grundsätzlich alle Antikörper, die gegen das SARS-CoV-2-Virus gerichtet sind, unabhängig davon, ob sie protektiv, d. h. neutralisierend, sind oder nicht. In einem entsprechenden Neutralisationstest wird in einer Zellkultur geprüft, ob die Antikörper eines Patientenserums eine Infektion von suszeptiblen Zellen mit replikationsfähigen SARS-CoV-2 verhindern können. Da SARS-CoV-2 ab Ende März 2020 in die Risikogruppe 3 eingestuft wurde [1], sind die für Neutralisationstests notwendige Arbeiten nach § 5 BioStoffV nur in Laboratorien der Schutzstufe 3 möglich und können derzeit (noch) nicht in der Sektion XXIB durchgeführt werden. Daher arbeitet die Abtleitung XXI eng mit InstMikroBioBw zusammen und stützt sich auf die dort vorhandenen Laborstrukturen und Fähigkeiten ab.

Fazit

Die Entscheidung zur Etablierung der SARS-CoV-2-Diagnostik in der Abteilung XXI des BwZKrhs Koblenz erfolgte noch bevor die WHO den Ausbruch des Virus zur Pandemie erklärt oder das RKI eine Gefährdung für Deutschland ausgesprochen hatten. Hierdurch konnten frühzeitig die infrastrukturellen und materiellen Voraussetzungen für die Validierung des molekularbiologischen Nachweissystems geschaffen werden. Durch kontinuierlichen Ausbau der Testkapazitäten und des Personalpools an molekularbiologisch ausgebildeten MTALab kann nun die Fähigkeit zur täglichen Durchführung von bis zu 200 Analysen in der Akutdiagnostik vorgehalten werden. Abgerundet wird das infektionsdiagnostische Portfolio der Abteilung XXI durch eine Antikörperbestimmung im ELISA- und CLIA-Verfahren. Somit liegen die Fähigkeiten zur individualmedizinischen Patientenversorgung sowie für infektionsepidemiologische Untersuchungsleistungen in der Abteilung XXI des BwZKrhs Koblenz vor.

Literatur

1. Ausschuss für Biologische Arbeitsstoffe (ABAS): Begründung zur vorläufigen Einstufung des Virus SARS-CoV-2 in Risikogruppe 3 und Empfehlungen zu nicht gezielten Tätigkeiten (Labordiagnostik) und gezielten Tätigkeiten mit SARS-CoV-2 2020; , letzter Aufruf 10. Mai 2020. mehr lesen
2. Corman VM, Landt O, Kaiser M et al.: Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill 2020; 25(3): 2000045. mehr lesen
3. Foundation for Innovative New Diagnostics: SARS-COV-2 diagnostic pipeline. FIND 2020; , letzter Aufruf 19. Mai 2020. mehr lesen
4. Okba NMA, Müller MA, Li W et al.: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2-Specific Antibody Responses in Coronavirus Disease 2019 Patients. Emerg Infect Dis 2020; 26(7): 8. April 2020 (published ahead of print), , letzter Aufruf 10. Mai 2020. mehr lesen
5. Wölfel R, Corman VM, Guggemos W et al.: Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature 2020;581: 465-469. mehr lesen
6. World Health Organization: Laboratory diagnostics for novel coronavirus. WHO 2020. (Text stand bis Mai 2020 zur Verfügung)
7. Zhang Y-Z: Novel 2019 coronavirus genome. Virological 2019; , letzter Aufruf 8. Mai 2020. mehr lesen
8. Zhao J, Yuan Q, Wang H, et al.: Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019. Clin Infect Dis 2020; 28. März 2020 (published ahead of print). mehr lesen

Manuskriptdaten

Zitierweise

Balczun C, Granzer H, Fengler I, Rojak S, Klein N, Scheid P, Hagen RM: SARS-CoV-2- Diagnostik in der Abteilung XXI des BundeswehrZentralkrankenhauses Koblenz. WMM 2020; 64(S1): e18.

Für die Verfasser

Oberstleutnant d. R. Dr. Carsten Balczun

BundeswehrZentralkrankenhaus Koblenz

Abteilung XXI – Medizinische Mikrobiologie

Andernacher Str. 100, 56070 Koblenz

E-Mail: carstenbalczun@bundeswehr.org